B-27无血清添加剂（B-27 supplement,serum free）神经干细胞培养手册

概述

神经干细胞(neural stem cell)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。

在神经干细胞培养中B-27与N-2添加剂的使用十分广泛，B-27是一种最常被引用的神经细胞培养添加剂，是一种优化的无血清添加剂，用于支持胚胎、出生后和成年海马神经元和其他中枢神经系统（CNS）神经元的生长和活性维持。

图1. 神经干细胞的发展历程

神经系统疾病及治疗机理

神经系统疾病是指发生于中枢神经系统或周围神经系统的以感觉、意识、运动等障碍为主要表现的疾病。包括帕金森病、阿尔茨海默病、卒中、肌萎缩性侧索硬化症（渐冻症）、多发性硬化症、亨廷顿病、小脑萎缩、脊髓损伤、外伤性脑损伤等。

神经干细胞的治疗机理是：（i）患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位；（ii）神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复；（iii）神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路。

B-27在神经干细胞培养中的作用

1、优化产前和胚胎神经元的活性和长期存活率；

2、保证神经来源的肿瘤细胞系的活性；

3、扩增来自小鼠胚胎纹状体和中脑的EGF响应性的前体细胞。

神经干细胞培养实验步骤

1. 完全培养基制备

【注】原代海马神经元培养，神经元完全培养基需要额外补充25 μM的L-谷氨酸，在培养的第4天以后的换液中应不再添加L-谷氨酸。配置好的完全培养基，可于2-8℃的避光保存一周。

2. 细胞培养步骤

下列步骤已在大鼠胎儿原代海马和皮层神经元，以及神经母细胞瘤细胞系中测试。

1) 用无菌的冷的0.05 mg/mL多聚赖氨酸水溶液包被培养表面(玻璃或细胞培养级塑料)，每平方厘米表面使用0.15 mL，在室温下保温1 h。

2) 去除多聚赖氨酸溶液，并用无菌蒸馏水冲洗两次(须彻底清洗，因为多聚赖氨酸对细胞有毒性)。在超净工作台中打开培养板的盖子通风，直到每个孔都完全干燥。培养板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周。

3) 根据标准实验室程序或随细胞提供的说明书分离原代的大鼠神经元或解冻冻存的原代大鼠神经元。

4) 在预热的(37°C)神经元完全培养基中（如前所述的方法制备)接种细胞，建议的细胞密度为160个细胞/mm2，或必要时使用自行优化的细胞密度。

【注】对于海马神经元，培养基中须添加25 μM L-谷氨酸，参见“完全培养基的制备”。

5) 在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮湿环境中培养（使用自然空气也是可接受的，但推荐含9%氧气和5%二氧化碳的气体环境）。

6) 培养4-24 h后，更换一半体积的新鲜培养基，继续在培养箱中培养。

7) 对海马神经元以外的细胞：在接种4天后，更换一半体积的新鲜的完全培养基，之后每三天重复一次。对海马神经元：接种三天后，用不含L-谷氨酸的新鲜培养基更换一半体积的培养基。之后每三天重复一次。

【注】在完全培养基中添加25 µM 2-巯基乙醇，可改善海马神经元的长期存活率。

3. 分离原代大鼠胚胎神经元

下列程序推荐用于培养受精18天的大鼠胚胎海马神经元和大脑皮层神经元。

1) 从受精18天的大鼠胚胎中分离大脑皮层和双侧海马

2) 在预置了Hibernate-E完全培养基的锥形管中收集所有的组织。放置，直到所有的组织都已解体。

3) 使组织沉积在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下刚好可覆盖组织的最少量的培养基。

4) 在不含钙离子的Hibernate-E培养基中，使用2 mg/mL过滤灭菌的木瓜蛋白酶溶液，在30°C酶解组织大约30 min，其间每5 min轻摇锥形管以帮助降解。每对海马组织使用2 mL酶溶液。

5) 加入两倍体积的Hibernate-E完全培养基以恢复二价阳离子的浓度，停止酶解。

6) 使未解离的组织沉降至管底（约2 min），然后把上清液转移到15 mL离心管中，以150×g离心5 min。

7) 在1 mL神经元完全培养基中重悬沉淀物，取一小份(例如10 μL)进行细胞计数。后续的操作按照“复苏和培养冻存的神经元”的第8-10步骤进行。

4. 复苏和培养冻存的神经元

原代神经元细胞将会贴附在裸露的塑料或玻璃表面，建议事先用神经元完全培养基冲洗所有的塑料和玻璃器皿的内表面，以获得最高的回收率和产量。由于细胞从冻存状态复苏时极其脆弱，请在整个操作过程中不要震荡或离心细胞。我们建议每次只解冻一管细胞。务必减少从液氮中转移冻存管到37°C水浴中的操作时间。细胞从液氮罐到水浴的运输过程中，可在冰桶中放少量液氮，将细胞置于这个冰桶中来进行。

1) 在解冻细胞之前，用神经元完全培养基冲洗无菌的15 mL锥形管，然后在超净工作台中通风晾干。

2) 从液氮中取出冻存管时可稍微拧松管帽以释放压力，然后再拧紧。

3) 在37°C水浴中轻柔搅拌冻存管以快速解冻细胞（＜2 min）。当观察到冻存管中只有很少量的冰晶存在时（触摸冻存管仍然感觉是冷的）从水浴中取出。

4) 在超净工作台中用70%的异丙醇消毒冻存管。在工作台台面上轻敲冻存管以使管内液体沉降到管底。

5) 使用事先用神经元完全培养基冲洗并干燥过的1 mL吸头极其轻柔地将细胞转移到事先冲洗并干燥的15 mL锥形管中。

6) 用1 mL预热的神经元完全培养基冲洗冲洗冻存管，以每秒一滴的速度极其缓慢地加入到15 mL锥形管中的细胞里。每加一滴都轻柔地转动锥形管一次。不要一次即把全部培养基加到锥形管中。

7) 慢慢地逐滴加入另外2 mL预热的完全培养基，使管内的液体体积为4 mL。用1 mL吸头轻柔地混合液体，注意不要造成任何气泡。

8) 用一个事先冲洗干燥过的吸头吸取10μL细胞悬液加入到含有10μL 0.4%台盼蓝的微量离心管中，轻敲管壁以混匀溶液。使用手动的细胞计数方法测定活细胞密度。解冻的细胞的活率应超过50%。

9) 在已经事先用多聚赖氨酸包被（参见“细胞培养步骤”）的48孔板中每孔中接种大约1×105个细胞或按所需的细胞密度接种。加入预热的神经元完全培养基将细胞悬液稀释到每孔500μL。

10) 按照“细胞培养步骤”中的5-6步骤进行神经元的培养。在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮湿环境中培养（使用自然空气也是可接受的，但推荐含9%氧气和5%二氧化碳的气体环境）。

常见问题

名词小贴士：

神经（Nerve），是由聚集成束的神经纤维所构成。 而神经纤维本身是由多个神经元细胞构成，其神经元的构造为轴突外并被神经胶质细胞所形成的髓鞘包覆。 如此神经能将讯息从动物身体一处传递到另外一处，使动物能协调指挥动作与进行各种工作。

神经元（neuron），又名神经原或神经细胞，是神经系统的结构与功能单位之一。人脑中，神经细胞约有860亿个。

神经干细胞（NSCs），是自我更新的多能细胞，可分化为神经系统的主要表型。这些细胞类型包括神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。

神经祖细胞（NPC），是干细胞分裂的后代，其通常在体内经历有限数量的复制循环。大脑中有许多“专业的”细胞，比如神经细胞，少突胶质细胞和星形胶质细胞。神经细胞传递和接受信息。少突胶质细胞包裹着神经细胞，为神经细胞更快地传递信息提供帮助。星形胶质细胞(星形细胞)通过提供营养和从身体的其他部位调节进入大脑来支持神经系统。

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