抗体捕获神器，轻松搞定IP/COIP

——Protein A /G 琼脂糖或磁珠

Protein A、Protein G是最常应用于抗体亲和纯化和免疫沉淀的蛋白。 Protein A/G琼脂糖或磁珠将Protein A、G共价偶联到介质表面，具有结合能力更强、结合范围更广、实用性更高的特点。

1、纯化抗体：一步纯化即可从血清或腹水样品中分离出高纯度的抗体。

2、免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）：通过对某蛋白质的富集，研究该蛋白的特性（如翻译后修饰等）。

3、免疫共沉淀Co-IP(co-Immunoprecipitation)：通过对某蛋白质的富集，研究与其结合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白复合物等）。

1、Protein A/G 4FF Agarose纯化兔血清中的抗体。

图1 Protein A/G 4FF Agarose纯化抗体结果电泳图

2、整个实验设计中，为了进一步阐明Atuveciclib在IL-1b诱导的基质降解中的作用。研究人员在IL-1b刺激30 min前，先利用Atuveciclib预处理人和大鼠NP细胞2h，然后使用针对p65和细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）的特异性抗体对提取的总细胞蛋白进行免疫沉淀分析。结果发现， IL-1b刺激增强了p65和CDK9之间的相互作用，而Atuveciclib减弱了这种作用。

Fig 2. Immunoprecipitants were then subjected to western blot analysis using specific antibodies against CDK9 and p65.

1、Co-IP背景较深或者条带杂乱

● 固相基质的非特异性结合

● 抗体结合非特异的蛋白

● 洗涤不当造成杂带

● 建议方案：pre clear或者更换磁珠；设置对照排除非特异性条带；优化缓冲液

2、Input条带清晰，co-IP条带很弱？

设X为诱饵蛋白，Y为靶蛋白，有可能为

● X和Y的相互作用本身比较弱

● X蛋白并不是Y的唯一，只部分Y与X互作

● 可以尝试反向拉，比如用Y去拉X，可能效果比较好

3、我的蛋白正好和抗体重链分子量接近，要如何减少抗体干扰？

● IP/WB一抗使用不同种属来源，选择与IP抗体种属无交叉反应的二抗(Cross Adsorbed secondary antibody)

● 特殊二抗：比如仅识别重链或者轻链的二抗，或者仅识别天然抗体的二抗

● 直接源头遏制：将抗体直接交联到bead上，或者将抗体交联到protein A/G上，避免洗脱干扰

4、靶蛋白没有条带

● 裂解液不合适，或者没有添加抑制剂，导致靶蛋白或者饵蛋白构象改变不能结合或者降解

● 饵蛋白较难洗脱，换成高强度的洗脱缓冲液

● 选用的抗体不合适，建议IP验证过的抗体，并优化下抗体用量

● 蛋白间为弱相互作用，或者相互作用依赖翻译后修饰

5、琼脂糖难离心，每次总会吸上来一点儿

● 使用带滤膜的离心柱，下部有接样管，琼脂糖完全截留在滤膜上

● 换成磁珠

6、我的目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀

● 若此蛋白带标签，可选择针对此蛋白的标签抗体来进行免疫沉淀。