组织裂解

(1) 称取100mg脑组织，剪碎后放入研钵中，然后加入液氮研碎组织，直至成粉末状；

(2) 加入1ml裂解液（裂解液中含有临时加入的10μl蛋白酶抑制剂混合物），研磨，直至成为液体；

(3) 转至EP管，冰上静置10min；

(4) 4℃，12, 000r.p.m.，离心10min，取上清（胞浆蛋白）；

(5) －80℃，分装冻存。

制备SDS-PAGE 凝胶

(1) 将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。

(2) 配制10%分离胶8ml（见下表），快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。

(3) 立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合），室温放置约40min至分离胶凝固。

(4) 配制5%浓缩胶4ml（见下表）。

 10%分离胶
 5%浓缩胶
 
体积
 8ml
 4ml
 4ml
 2ml
 
ddH2O
 3.2ml
 1.6ml
 2.72ml
 1.36ml
 
30%丙烯酰胺
 2.67ml
 1.33ml
 0.66ml
 0.33ml
 
1.5M Tris-cl (PH 8.8)
 2.0ml
 1.0ml
 
 
 
1.0M Tris-cl (PH 6.8)
 
 
 0.5ml
 0.25ml
 
10%SDS
 0.08ml
 0.04ml
 0.04ml
 0.02ml
 
10%AP
 0.08ml
 0.04ml
 0.04ml
 0.02ml
 
TEMED
 3.2μl
 1.6μl
 4μl
 2μl
 

(5) 倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约40 分钟。

(6) 轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。

样品变性及电泳

(1) 由-80℃冰箱取出提取的组织总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。

(2) 根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，95℃变性10分钟，立即插入冰中待用。

(3) 将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8v/cm）。电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。

3.4  凝胶转膜及其检测

凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。用于Western 印迹法的固相支持物有多种，本实验采用PVDF膜作为固相支持物。本实验采用湿转的转膜方式。

(1) PVDF膜的预处理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、电转液依次漂洗2min×2次，置于电转液中备用；

(2) 剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。

(3) 取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次。

(4) 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片→3 层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。

(5) 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，65v转膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中进行）。

(6) 封闭：小心取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h。

(7) 一抗反应：将一抗用封闭液稀释1000倍；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反应过夜。

(8) 洗膜：将反应膜放入平皿中，用1× TBST 洗涤三次，（室温下缓慢摇动洗涤）每次10 分钟，洗净未结合的一抗。

(9) 二抗反应：将二抗用1×TBST 稀释3000 倍；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用60 分钟。

(10) 洗膜：用1×TBST 洗膜，方法同(8)，洗去游离二抗。

(11) 曝光及洗片：

①按1：1（v/v）混合ECL 试剂盒中两种液体。

②将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用4分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住PVDF膜。